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視頻標(biāo)簽：血紅蛋白的,提取和分離
所屬欄目：高中生物優(yōu)質(zhì)課視頻
視頻課題：人教版高中生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐課題5.3血紅蛋白的提取和分離-湖南省優(yōu)課
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課題5.3 血紅蛋白的提取和分離
教學(xué)目標(biāo)：
1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白
2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學(xué)重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法
教學(xué)難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 教學(xué)過(guò)程：
（一）引入
蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化合物。對(duì)蛋白質(zhì)的研究有助于人們對(duì)生命過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢？
（二）新課 1．基礎(chǔ)知識(shí)
血紅蛋白存在于什么細(xì)胞中？ 怎樣使其釋放出來(lái)？
如何使血紅蛋白與其他蛋白質(zhì)分離開(kāi)？
蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。
1．1凝膠色譜法（分配色譜法）： （1）原理：（見(jiàn)課件圖） 分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。
（2）凝膠材料：多孔性，多糖類(lèi)化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。
（3）分離過(guò)程：
混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 1．2凝膠電泳法：
（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。
（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。
（3）分離過(guò)程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。
1．3緩沖溶液
（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。
（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。
2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
2.1蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。
2.2選擇實(shí)驗(yàn)材料
（1）你認(rèn)為鳥(niǎo)類(lèi)血液和哺乳動(dòng)物血液中，最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白？為什么？
（2）請(qǐng)閱讀投影資料，認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問(wèn)題：
血液由 和 兩部分組成。
血細(xì)胞中 細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2
和CO2結(jié)合的 基團(tuán)。
2.3從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為：洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么？
紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為
血液＋檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水 →緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色
紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000c/min×10min）→濾紙過(guò)濾除去脂
思考：是否所有種類(lèi)的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的？為什么？ 不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。
哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核，血紅蛋白含量高。 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。 思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？
防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考：你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)？ 加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。
補(bǔ)充：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時(shí)，紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學(xué)家采取了離心分離的方法：
質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白
在透析過(guò)程中，血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH＝7的磷酸緩沖液中。
總結(jié)：通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程，紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其他種類(lèi)的蛋白質(zhì)分子（如呼吸酶等）。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開(kāi)來(lái)呢？我們來(lái)研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟――粗分離（凝膠色譜操作）。
2.5凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖5－19，說(shuō)出制作色譜柱需要的材料。
橡皮塞2個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過(guò)程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進(jìn)行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請(qǐng)閱讀教材： 色譜柱的裝填過(guò)程。
步驟
操作要求
① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計(jì)算稱(chēng)量凝膠 根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入；輕輕敲打 ⑤
緩沖液洗滌平衡
立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h
樣品加入和洗脫。其基本過(guò)程是：
調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì) 至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng)： （1）紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。 （2）凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡
（3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。
（4）色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。 （三）課堂總結(jié)
思考：如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢？。
透析。半透膜的選擇透過(guò)性，大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜，離子和小分子能夠通過(guò)半透膜。 思考：為何使用pH＝7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。
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